01文章概览

　　原文标题：

　　Integrated single-cell and spatial transcriptomic profiling reveals higher intratumour heterogeneity and epithelial–fibroblast interactions in recurrent bladder cancer

　　中文标题：综合单细胞和空间转录组分析揭示了复发性膀胱癌更高的肿瘤内异质性和上皮-成纤维细胞相互作用

　　DOL：10.1002/ctm2.1338

　　期刊名：Clin Transl Med

　　影响因子IF：10.6

　　发表时间：2023.7

　　相关技术：单细胞测序、空间转录组测序、免疫荧光

 

　　02导读

　　膀胱癌(BLCA)是泌尿道最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的主要原因。大多数(75%)BLCA病例是非肌肉侵入性的，可以经尿道切除作为一种治疗策略。然而，有很高的复发几率(50% - 70%)和进展为肌肉侵袭性BLCA(20%)。目前BLCA发生和复发的机制尚不清楚。利用单细胞RNA测序(scRNA - seq)，研究人员可以在单细胞水平上分析转录组，探索肿瘤微环境(TME)内细胞的多样性，并观察细胞相互作用。尽管scRNA - seq提供了基于单个细胞的转录信息，但是当组织样本在测序前均质化时，空间细胞信息通常会被破坏，从而忽略了细胞在其原生组织景观中的组织和相互作用。在这种情况下，采用空间转录组学(ST)来解决空间信息的丢失。利用空间作图方法，可能最好地保留感兴趣区域的组织学背景，这有助于定位肿瘤内部的不同功能区域，并评估肿瘤内外基质或免疫细胞的变化。将ST与scRNA - seq相结合，有助于在组织切片上可视化数千个基因，并在其物理位置上绘制分析物，从而使分析单细胞之间的相互作用成为可能。

　　在当前的研究中，我们试图分析复发性BLCA个体组织切片的全转录组数据。这项研究可以促进生物标志物指导下对复发性BLCA患者的监测和管理，并有助于更好地理解该疾病的致病机制。

 

　　03技术路线图

　　04研究方法

　　本研究整合了单细胞RNA（scRNA）测序和ST谱分析，以检查六个膀胱癌组织（三个来自原发性肿瘤，三个来自复发性肿瘤）的肿瘤微环境（TME）。

 

　　05主要结果

　　01RCC原发和转移部位scRNA-seq图谱

　　Figure 1A-E

　　为了研究原发性和复发性膀胱肿瘤的细胞多样性和转录组异质性，我们收集了6例患者的组织，并使用10x Genomics平台进行了配对的10x单细胞测序和空间转录组测序。根据患者的临床分类，将组织分为两组:原发性肿瘤和复发性肿瘤。在进行单细胞转录组分析之前，我们对数据进行了筛选和处理。批量集成后，共收集了59858个单元，平均为6947个UMI(2041个特征)，用于下游降维和单元聚类。使用UMAP将数据可视化。该分析确定了27个初始细胞簇(图1A)。接下来，我们应用deCS软件和文献中的典型标记基因将这些集群划分为17个主要细胞集群(图1B,C)。我们注意到一些细胞亚群对批次有强烈的偏好，即使UMAP分析表明，批次影响在三个不同的批次中可以忽略不计(图1D和S1)。基于CNV分析，我们应用intercnv验证上皮细胞具有最强的CNV改变，表明正常上皮细胞的存在有限(图1E)。

 

　　02原发性和复发性膀胱肿瘤组织的细胞间相互作用分析之间的差异

　　Figure 1F-K

　　接下来，我们研究了细胞通讯的差异，以揭示原发性和复发性肿瘤之间的失调通路。图1F显示，在复发性膀胱肿瘤中，细胞相互作用的总数和强度都增加了。如图1G的结果所示，在基底细胞、1型DC(浆细胞样DC)和NK细胞的传入信号和巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞的传出信号中检测到大多数差异相互作用。对于每一对L-R信号通路，我们还评估了信息流。在复发性肿瘤中，共有92个L-R对出现异常(表S2)。如图1H所示，大多数与炎症和免疫反应相关的信号通路在复发性肿瘤中显著上调。例如，复发性肿瘤的基底细胞、T细胞和NK细胞之间的LCK通路被激活(图1I)。最近的一份报告表明，LCK参与了初始T细胞和效应T细胞中T细胞受体信号的激活。同样，PTN表达通过炎性细胞因子的表达引起白细胞迁移，从而诱导白细胞应答，表明在复发性上皮细胞中有更强的通讯模式(图1J)。此外，具有调节免疫和炎症反应作用的CXCL1在复发性巨噬细胞和内皮细胞中显著增强(图1K)。然而，考虑到两种或两种以上类型细胞的大多数物理相互作用需要接近性，转录组水平的scRNA - seq数据可能无法提供细胞间串扰的完全准确视图。

 

　　03空间转录组学解决了膀胱肿瘤的转录组异质性

　　Figure 2A-E

　　scRNA‐seq提供了高度异质性细胞群体的转录组谱，使其更容易找到区分不同细胞亚型的基因。这种新的ST技术使我们能够检查组织中的空间基因表达模式，并表征局部结构和微环境，从而介导跨不同空间位置的细胞-细胞相互作用的检测。使用10x Visium ST技术，我们在6个空间样本中生成了25 477个条形码点，平均6230 UMI(2148个特征)。为了在空间水平上更好地表示原发性和复发性膀胱肿瘤的空间异质性(表1)，我们使用Seurat v4.0基于锚点的集成进行了数据预处理和批次效应去除(详见第2节)。在对空间条形码点进行无监督聚类和UMAP可视化后，在六个不同样本中确定了七个不同的聚类(图2A,B)。根据供体身份将整个斑点池细分为6个单独的斑点，结果显示所有的群集都出现在所有样本中(图2C)，表明批效应已经最小化。为了检测区域特异性标记基因，我们进行了DEG分析(图2D)，并使用Giotto PAGE(来自scRNA - seq的区域特异性标记基因和细胞类型特异性基因的整合分析)来注释每个点簇中的优势细胞类型。此外，我们发现在所有三个复发肿瘤中C2细胞(成纤维细胞和平滑肌细胞)的比例升高(图2E)，表明微环境更复杂。

 

　　04空间转录组反卷积分析显示复发性肿瘤具有较高的异质性

　　Figure 2F-H

　　为了量化每个位点内细胞类型的贡献，我们使用Seurat v4.0基于锚定的集成技术将ST数据与scRNA - seq数据合并，因为10x Visium ST无法提供单细胞分辨率。首先，Seurat锚点方法找到两个数据集中元素之间的成对对应关系，作为数据集之间的锚点。这些成分似乎起源于相同的生物状态。空间数据中的每个位置都被视为scRNA‐seq发现的各种细胞类型的加权混合物。因此，为了确定scRNA‐seq对每个位点产生的每种类型细胞的权重，我们采用了标签转移预测评分。为了更好地理解，我们使用对齐的组织学图像生成了目标细胞类型的预测分数，如图2F所示。我们进一步研究了原发肿瘤和复发肿瘤之间的局部细胞类型异质性(贡献细胞类型的数量)。如图2G所示，我们发现所有三种复发肿瘤的局部细胞类型异质性(>5种细胞类型)(56.72%)大于原发肿瘤(40.96%，p值= 0.026,t检验)(表S4)。我们还检查了它们的相对成分。经常性组的Shannon多样性指数明显大于初级组，如图2H所示。我们认为这是由于复发性肿瘤较高的异质性和更强的免疫反应。总的来说，由于scRNA - seq和ST的整合，我们有可能在空间上阐明BLCA中细胞类型特异性基因的表达，反卷积分析显示复发肿瘤的斑点总体上具有较高的异质性。

 

　　05空间邻近分析揭示了复发组中上皮/基底细胞与NK和T细胞之间的细胞间相互作用增强

　　Figure 3A-E

　　细胞类型邻近图可用于指导相同或不同谱系的细胞类型之间的串扰识别，因为两个或多个细胞需要接近才能进行物理相互作用。首先，通过将观察到的细胞-细胞邻近相互作用的频率与每个样品的预测频率进行比较，确定了不同配对细胞类型之间的空间邻近富集或消耗（图S10）。有趣的是，细胞类型的空间近端差异分析显示，与原发组相比，复发组的C1（上皮细胞和基底细胞）和C0（NK和T细胞）之间的相互作用增强（图）3A和表S5），而复发组C1和C0的含量和比率与总斑点的比值较低。这一结果与单细胞水平的结果一致，表明复发性癌症表现出免疫和炎症信号通路的显着增加（表S1）。ST结果为这些细胞间相互作用提供了可见的证据（图3B).此外，我们观察到C4（成纤维细胞和内皮细胞）和C5（上皮和淋巴细胞）之间的相互作用在复发组中得到增强。然而，复发组C5（上皮细胞和淋巴细胞）和C2（成纤维细胞和平滑肌细胞）之间的相互作用减少（图3C).为了验证我们的发现，我们通过应用CellTrek进一步研究了不同细胞类型的空间共定位模式，30基于 scRNA-seq 和 ST 数据。我们证实了上皮细胞、角质形成细胞和基底细胞的共定位上调（图3D，E）与复发组中的NK和CD8 T细胞，这意味着复发组中的肿瘤微环境更为复杂。

　　Figure 4A-E

　　通过不同的生物信息学方法分析显示，复发组NK/T细胞和假定的肿瘤细胞相互作用增加。为了进一步验证我们的发现，我们对10个(5个原发和5个复发)肿瘤样本进行了多重免疫荧光分析，以检查NK/T细胞和上皮细胞的共定位。我们使用在scRNA - seq数据集中高度表达的标记，如EPCAM、cytokeratin‐8和cytokeratin‐19，来标记上皮细胞和基底细胞。CD3和CD8分别代表CD8+ T细胞，CD56/CCL22分别代表NK细胞和dc细胞。正如预期的那样，我们发现CD3/CD8和CD56/CCL22的细胞密度在复发组的肿瘤区域明显更高(图4A)。在间质中，复发组CD8+ T细胞多于NK细胞(图4B)。细胞角蛋白- 8被用作确定肿瘤区域和间质的标记(图4C)。还进行了定量分析，以显示原发性组和复发组之间NK/T和上皮/基底细胞共定位的差异(图4D,E)。总的来说，这些免疫荧光结果进一步表明复发性肿瘤的免疫复杂性增加。

 

　　06空间分析显示参与复发性肿瘤免疫反应和细胞粘附变化的基因增加

　　Figure 5A-G

　　我们确定了原发性和复发性肿瘤之间最显着的空间差异表达L-R相互作用(图5A).根据功能富集分析，这些L-R蛋白主要参与整合素介导的信号级联和异型细胞-细胞粘附（图5B).例如，我们发现复发性肿瘤中COL4A1和SDC1相互作用显着增加，其中两个代表性基因（SDC1和COL4A1）的表达水平（图5C，D）.这两种基因都在细胞外基质组织中发挥作用，并且以前与多种癌症进展和耐药性有关。事实上，还进行了多重免疫荧光实验，并验证了SDC1和COL4A1在复发组中的共定位增加（图5E），主要在肿瘤区域（图5F，G).总之，空间分辨的转录组学和成像数据显示，参与免疫应答和细胞粘附的基因相互作用在复发性膀胱肿瘤中普遍增强，特别是在癌症相关成纤维细胞（CAFs）中。

 

　　06总结

　　为了检查复发性BLCA组织的TME，我们在这项工作中对scRNA-seq和空间转录组谱进行了综合分析。首先，我们发现基于scRNA数据的ST反卷积分析显示复发性肿瘤的肿瘤异质性要高得多。其次，我们发现，虽然复发性肿瘤中NK/T细胞和恶性细胞总数或总细胞比例相似甚至更低，但这两种细胞类型之间的相互作用要强得多。最后，在复发性肿瘤中观察到CAF与其他免疫细胞之间的L-R相互作用增加。

　　与原发性BLCA相比，复发性BLCA具有更高的异质性，其特征是免疫细胞和基质细胞的复杂性更高。先前的研究表明，在各种肿瘤类型中，预先存在的肿瘤内异质性与染色体不稳定性、肿瘤侵袭性和耐药性有关。这种较高的异质性可能导致预后不良，并可能传递到复发性肿瘤组织。然而，这尚未在BLCA或其他肿瘤类型中得到验证。在以往的研究中，复发肿瘤样本通常与原发肿瘤样本具有相似的非恶性细胞(免疫和基质)亚型，但比例和功能状态不同。Wang等人发现复发性BLCA组织中含有与低危BLCA相似数量的免疫细胞，但免疫细胞少于高危BLCA。通过整合ST和scRNA - seq分析，我们首次在单个位点水平上观察到这种更高的复杂性。

　　参考文献：

　　Shi, Zhen-Duo et al. “Integrated single-cell and spatial transcriptomic profiling reveals higher intratumour heterogeneity and epithelial-fibroblast interactions in recurrent bladder cancer.”Clinical and translational medicine vol. 13,7 (2023): e1338. doi:10.1002/ctm2.1338

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