目前，大部分微生物合成产物过程都是用单一菌株来确保稳定的生产，然而单一菌株在执行多种代谢任务时十分困难。由此，微生物共培养体是一种生物生产应用的潜在平台。由于多种菌株导致需要复杂的过程控制，需要使用有效的种群控制策略来进行调控。通过遗传线路引导来调控菌群的生长，筛选合适的菌群来可以提高微生物共培养体的合成各类产物的效率是一种可行的策略。

　　本周为大家解读一篇韩国Gyoo Yeol Jung团队发表于Nature Communications期刊上题为“Circuit-guided population acclimation of a synthetic microbial consortium for improved biochemical production”的研究工作。该研究发现，遗传线路引导的方式可以提高微生物共培养体的生物合成的产量。该研究设计了一种弧菌DHG(Vibrio sp. DHG)和大肠杆菌(Escherichia coli)组成的微生物共培养体，将海藻酸盐转化为3-羟基丙酸（3-HP）。通过在大肠杆菌中引入“种群引导者”的基因回路使得只有在菌株产生3-HP时才能降解氨苄西林，在氨苄西林的选择压力下，通过发酵，使得该微生物共培养体的3-HP产量相比于简单的共培养方式提高了4倍。

 

　　1

　　利用海藻酸盐生产3-HP的微生物共培养体

　　作者筛选与构建一株利用海藻酸盐的弧DHG与大肠杆菌ECFHP组成共培养体。（以下简称DHG与ECFHP(S)）大肠杆菌本身不能利用海藻酸盐生产3-HP。而DHG可以将海藻酸盐代谢生成乙酸盐，乙酸盐作为ECFHPS的碳源可以被其利用来生产3-HP。（从10 g/L的乙酸盐中可以产生272.82 mg/L的3-HP）研究发现，由于DHG可以为ECFHPS提供碳源，而ECFHPS对DHG的生长没有显著促进作用，这会导致DHG具备生长优势从而抑制大肠杆菌的生长。为了平衡两株菌的共生关系，作者设计了一种种群引导器来获得生产3-HP的最佳种群比例。这一引导器在3-HP存在的条件下可以表达氨苄西林降解基因bla。在氨苄西林存在时抑制DHG的生长。

　　图1基因回落引导下的微生物群落适应策略以提高3-羟基丙酸（3-HP）的产量

 

　　2

　　共培养体的自由培育

　　为了监测微生物共培养体的构成，以mCherry与sgfp引入DHG与ECFHP中构建VDHG与ECFHPS。控制VDHG与ECFHPS的OD600值分别为0.5与2进行接种培养。结果发现，在海藻酸盐存在的情况下，DHG生长速度显著高于在乙酸盐存在时的ECFHP（分别为0.83 h-1和0.16 h-1）。由此，以DHG与ECFHP两种菌株进行共培养。初期，在添加海藻酸盐的培养液中发现DHG的快速生长，同时观察到乙酸的积累，表明DHG对共培养的菌体生长阶段作出了积极反应。在12小时，3-HP的积累达到了38.45 mg/L，表明微生物共培养体可以直接从海藻酸盐制备3-HP。但在发酵过程中，乙酸水平保持在较高水平（max=1.83 g/L），即使降低乙酸的水平，3-HP的生成依旧偏低。通过分析菌群构成发现，ECFHPS随着发酵时间比例显著下降（min%=8.25%）。这些结果表明，实现高效生产3-HP需要避免DHG的过度生长。

　　接着测试了四种不同的VDHG和ECFHPS菌株的接种比例(0.5：4、0.5：1、0.1：2.4和2.4：0.1)对3-HP生产的影响。结果表明种群比例的变化对3-HP的产量有显著影响。48小时，3-HP滴定值从近似于零变化到了211.05 mg/L（增加了4倍），这表明微生物群落对3-HP产量的重要性。特别是当VDHG的初始量很大时，3-HP的产量会大幅降低，可能是由于ECFHPS菌株的生长不良引起的。尽管进行了接种量的控制，但高水平的乙酸仍然持续存在，这表明3-HP的产量仍有很大提升空间。另外，作者还发现在海藻酸盐被耗尽后，3-HP的降解也经常发生，可能是由于两种微生物中的任意一种对其进行了降解，这也暗示了高效的碳利用的必要性。

　　图2VDHG和ECFHPS菌株组成的微生物共生体系通过海藻酸盐制备3-HP

 

　　3

　　种群引导器用于3-HP依赖性生长的调节

　　为了使得微生物共培养体更高效的进行3-HP的生产，作者构建了一种种群引导器并对其可控性进行了测试。使用来自脱氮假单胞菌的一种3-HP诱导响应系统，包括转录因子（C4-LysR）以及同源启动子（PC4M）。为了有效控制β-内酰胺酶（bla）的3-HP依赖性表达，评估了两个具有不同表达水平的5’-UTR序列（强和弱）。结果发现，强5’-UTR序列将导致菌株对3-HP的非依赖性，这可能是由于bla的高基础表达所致。因此，选择具有弱β-内酰胺酶表达水平的种群引导器进行后续研究。

　　接着通过外源添加3-HP来测试这种引导器的可控性。以1:4比例接种培养VDHG与ECPG（导入pPopG质粒的ECFHP），考虑到VDHG与ECPG的生长速度，控制氨苄西林浓度（0、1、2、5、10和20 µg/mL）监测共培养体的生长。为了诱导bla基因的表达，使用了三种不同浓度的3-HP（0、0.5和2 g/L）。结果发现，在培养24小时后氨苄青霉素浓度在1至10 µg/mL范围内时，当3-HP存在时，该共生体系通常出现更好的生长。随着氨苄西林浓度的提高，微生物共培养体由于对3-HP的依赖性产生的生物量差异更加显著。但当氨苄西林浓度过高时（20 µg/mL），生长效益不明显，这可能是由于对两个菌株的生长抑制过度。尽管如此，这个结果表明了种群引导器在响应培养基中存在3-HP的情况下调节微生物共生体系的生长的潜力。

　　图3不同氨苄西林浓度条件微生物共生体系的生长受3-HP依赖性控制

 

　　4

　　微生物种群对3-HP的适应性生产

　　应用种群引导策略，通过在氨苄青霉素存在下，使VDHG菌株与ECFHPG菌株（一种含有pPopG-3HP质粒的工程ECF菌株）共培养体稳定地利用海藻酸盐生产3-HP。在初次发酵过程中，将添加5ug/mL的氨苄西林样品组与未添加氨苄西林的进行了比较分析。结果发现，在没有氨苄西林的情况下，共培养体产生的3-HP与原始的共培养体产量一致。这表明种群引导器没有影响到培养过程。当添加5 µg/mL氨苄西林时，伴随着海藻酸盐消耗速率的下降，共培养体的生长速率略微下降。3-HP滴度升高（125.40 mg/L）和少量的乙酸积累（最多为1.44 g/L），表明通过种群控制改善了3-HP的产量。随后，监测共培养体系中ECFHPG的比例发现，在48小时，ECFHPG从18.50%增加到29.15%。这种比例变化使得碳通量向3-HP的代谢途径增强，即3-HP的C-摩尔收率增加了1.89倍。

　　进一步增加了氨苄西林的添加量（10 ug/L）后发现VDHG菌株的生长几乎被完全抑制。种群引导器成功地引导了共培养体的协作，使得在过量的氨苄西林环境中共培养体的OD600达到了13.99。这进一步增加了3-HP的生产（达到293.55mg/L），相较于未添加氨苄西林的条件下，48小时发酵后产量提升了4.3倍，乙酸积累量也显著降低。（18小时候无法检测到）。这也表明ECFHPG菌株的活性变得更高，其丰度增加了2.2倍。C-摩尔的3-HP收率相对于未添加氨苄青霉素时增加了4.38倍，这表明种群控制策略有助于成功培养种群以提高3-HP的产量。

　　继续增加氨苄西林的添加量（20 ug/L）来确认是否可以进一步提升3-HP的产量。但结果显示共培养体的生长遭到抑制，海藻酸盐的消耗量与生物量显著降低。因此，乙酸水平也保持在了较低水平。然而，在如此高的选择压力下，共培养体在12小时的发酵时间内生产出了199.40 mg/L的3-HP，C-摩尔收率最高。这可能是由于VDHG菌株无法生存导致ECFHPG没有充足的乙酸供应来生产3-HP。

　　图4通过综合调控微生物共生体系增加3-HP的产量

 

　　5

　　3-HP依赖性bla表达策略与非依赖性表达策略的比较

　　通过分别构建含有不同强度启动子（PJ23112、PJ23100和PJ23119）的pC112-3HP、pC100-3HP和pC119-3HP三种质粒来表达bla。在10 μg/mL氨苄西林条件下，共培养VDHG和ECFHPC1-3菌株（用上述三种质粒代替种群引导器）。结果表明，在采用PJ23119启动子表达bla的情况下，最终达到最高生物量，说明氨苄西林的降解最多。在48小时内，该策略使得共培养体最多生产了168.00 mg/L的3-HP，高于在没有添加氨苄青霉素的情况下VDHG和ECFHPG共培养的情况，表明简单的共培养策略对于3-HP的产生也是有优势的。然而， 3-HP的产量与启动子强度之间的没有显著相关性。此外，1~2 g/L的乙酸一直积累到24小时，这说明与先前的3-HP依赖性bla表达策略相比，非依赖性的表达策略不是最佳的选择。

　　进一步通过比较海藻酸盐的消耗与剩余乙酸的关系来预估两种菌株的细胞生长和不同条件下的3-HP的产量。结果表明，3-HP依赖性的bla表达策略可以通过弧菌DHG和产生3-HP的大肠杆菌的共培养有效地提高3-HP的产量。

　　图510μg/mL氨苄西林条件下微生物共培养体（VDHG和ECFHPC1-3菌株）的发酵特征

　　图6 3-HP依赖条件与非依赖条件条件下微生物共培养产3-HP与乙酸及对应生物量

　　综上，该研究开发的种群引导器共培养技术相较于简单的共培养或静态培养技术更具优势，它能使不同菌株合理地进行分工协作，简化复杂的代谢途径。但其中的种群引导器所展现出的引导作用是多菌种生物合成过程中的关键所在。该研究充分展示了基于基因遗传回路的种群引导策略是研发微生物共培养技术在高效生物生产过程中的一个很有前途的工具。微生物共培养体设计的高度灵活性可以促进新工艺的开发，通过使用多个模块化菌株从非传统原料中生产不同的生物化学品。

*本文系转载，如涉及版权等问题，请联系我们以便处理