布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)作为B细胞受体(BCR)依赖的细胞生长的关键介质，参与B细胞发育的各个方面，如增殖、凋亡和细胞迁移，BTK的上调与多种B细胞恶性肿瘤有关。伊布替尼作为首个上市的BTK抑制剂（BTKi），目前已被批准用于治疗多种B细胞肿瘤。泽布替尼作为另一种BTK抑制剂，在体外对BTK抑制的效力与伊布替尼相似，但在抑制白细胞介素-2诱导的酪氨酸激酶(ITK)方面，泽布替尼的效力约为伊布替尼的1/20。ITK是非受体性蛋白酪氨酸激酶Tec家族成员之一，参与T细胞的活化、细胞因子释放和增殖等，对ITK的抑制可促进免疫应答及抗肿瘤功能恢复。

 

　　嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗显著改善了淋巴瘤患者的疗效和生存期，但仍有部分患者对CD19 CAR-T细胞治疗无反应。以往研究显示1-5，伊布替尼联合CD19 CAR-T细胞治疗多种B细胞恶性肿瘤，促进CAR-T细胞扩增，提高疗效，这与伊布替尼通过抑制ITK通路而提高T细胞功能相关。天津市第一中心医院邓琦教授曾带领团队研究了伊布替尼与CAR-T细胞疗法在淋巴瘤中协同作用，并于2020年8月在Cancer Science期刊发表“Synergistic effect of ibrutinib and CD19 CAR‐T cells on Raji cells in vivo and in vitro”一文6，研究发现在皮下成瘤B细胞淋巴瘤小鼠模型中，伊布替尼与CD19 CAR-T细胞联合组小鼠具有协同作用，小鼠体内CAR-T细胞明显扩增，扩增比例高于CAR-T细胞治疗组，可以明显降低小鼠瘤负荷。

 

　　但同属于BTK抑制剂的泽布替尼联合CAR-T细胞治疗淋巴瘤的作用和效果尚不清楚，2022年10月，邓琦教授团队发表在Technology in Cancer Research & Treatment期刊上的“Synergistic Effects of Zanubrutinib Combined With CD19 CAR-T Cells in Raji Cells in Vitro and in Vivo”一文，对泽布替尼是否与伊布替尼一样，与CAR-T细胞具有协同作用做了初步探索7。

　　邓琦 教授

　　天津市第一中心医院 血液科

　　主任医师、硕士研究生导师

　　天津医师协会天津分会 常委

　　天津市医疗健康学会血液学专委会 常委

　　天津市医疗健康学会精准检测专业委员会 常委

　　天津医学会血液学分会 委员

　　中国抗癌协会血液肿瘤专委会 委员

　　中国免疫生物技术学会 委员

　　中国抗癌协会天津分会 委员

　　中国医药教育协会感染疾病专业委员会 委员

　　从事血液学临床工作二十余年，特别在生物免疫治疗方面的研究比较深入，将CAR-T 细胞、TCR-T细胞治疗技术成熟应用于恶性血液病的临床工作；同时开展相关基础实验和研发工作，主持、参与了十余项生物免疫治疗方面科研课题工作。注册多项细胞免疫治疗临床试验，以通讯作者发表SCI三十余篇。

 

　　研究方法

　　实验选取6周的雌性BALB/c裸鼠构建淋巴瘤小鼠模型，再将小鼠随机分为泽布替尼(2.5mg/kg, 2次/天)单药治疗组、伊布替尼(8mg/kg, 1次/天)单药治疗组、CD19CAR-T细胞(2×107/kg)单药治疗组、泽布替尼联合CD19 CAR-T细胞治疗组和伊布替尼联合CD19 CAR-T细胞治疗组。

　　CAR-T细胞来源于1例经CAR-T治疗失败的复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤（R/R DLBCL）患者，泽布替尼和伊布替尼每日经小鼠口灌胃给药。在第0、14和28天，通过生物发光成像和肿瘤体积测量来监测小鼠的疾病进展；在第0、7、14、28天通过流式细胞术（FCM）比较CAR-T治疗组、泽布替尼/伊布替尼联合CAR-T治疗组的CAR-T细胞扩增情况。

 

　　研究结果

　　体外泽布替尼/伊布替尼对淋巴瘤细胞株和CD19 CAR-T细胞增殖的影响

　　在体外，将Raji细胞，EHEB细胞，U-2932细胞分别与泽布替尼或伊布替尼共培养48h后，3种瘤细胞的增殖受到抑制。2种BTK抑制剂对增殖的抑制呈剂量依赖性(图1A)。

　　在0、1和15µM条件下培养24h、48h后，U-2932细胞增殖受到明显抑制。不同剂量的泽布替尼对淋巴瘤细胞的细胞毒性与伊布替尼相似(图1B)。此外，这两种BTK抑制剂在低浓度时对CD19 CAR-T细胞表现出轻微的抑制作用，在超高浓度会表现出明显的抑制作用(图1C)。

　　体外泽布替尼和伊布替尼诱导淋巴瘤细胞凋亡

　　在一定剂量的泽布替尼和伊布替尼作用下，淋巴瘤细胞的凋亡率呈时间依赖性增加，提示细胞凋亡可能是造成所观察到的淋巴瘤细胞增殖减少的原因之一(图1D)。

　　图1.（A）伊布替尼和泽布替尼以剂量依赖的方式抑制细胞增殖；（B）U-2932细胞的细胞增殖率（%）；（C）CD19 CAR-T细胞细胞增殖率（%）；（D）伊布替尼诱导淋巴瘤细胞凋亡（%）；（E）泽布替尼诱导淋巴瘤细胞凋亡（%）；（F）两种BTKi对CD19 CAR-T细胞的影响

 

　　两种BTK抑制剂对CD19 CAR-T细胞PD-1表达的影响

　　患者CD19 CAR-T细胞收获时，其PD-1的平均表达量为1.53±0.69%，CD19 CAR-T细胞与淋巴瘤细胞共同培养过程中，CD19 CAR-T细胞的PD-1表达增高；而共培养体系中加入伊布替尼组，CD19 CAR-T细胞中PD-1的表达增高程度下调，随着共同培养时间的延长，这种作用逐渐减弱，但在泽布替尼组中未观察到PD-1显著下降(图2和3A)。

　　图2.CD19 CAR-T细胞PD-1表达变化的流式细胞仪图谱

　　图3.（A）CD19 CAR-T细胞PD-1 表达（%）；（B）CD19 CAR-T细胞对Raji细胞细胞毒性（%）

　　在体外，CD19 CAR-T细胞联合泽布替尼对淋巴瘤细胞是否有协同作用？

　　分析CD19 CAR-T细胞联合泽布替尼与淋巴瘤细胞共同培养后24、48h的细胞毒性。在体外研究中，选择了相对较低的效靶比(E:T=1:3)，泽布替尼未提升CD19 CAR-T细胞对淋巴瘤细胞的细胞毒性(图3B)。

　　在体内，CD19 CAR-T细胞联合泽布替尼对淋巴瘤细胞是否有协同作用？

　　采用皮下淋巴瘤细胞异种肿瘤模型评估泽布替尼联合CD19 CAR-T细胞在体内的作用。在本研究中，单药泽布替尼/伊布替尼组、CD19 CAR-T细胞组以及CD19 CAR-T细胞联合泽布替尼组小鼠均未出现明显不良反应，仅CD19 CAR-T细胞联合伊布替尼组小鼠肿瘤负荷明显降低(图4A)。

　　图4.（A）各组的荧光素酶表达；（B）平均肿瘤体积（mm3±SEM）；（C）平均亮度（p/s/cm2/sr）；（D）伊布替尼和泽布替尼对CAR-T扩增的影响（%）

　　但伊布替尼+CD19 CAR-T细胞多药治疗组的肿瘤负荷缩小超过其他4组。在CD19 CAR-T细胞单独治疗组、泽布替尼组或泽布替尼联合CD19 CAR-T细胞治疗组中，肿瘤体积消退无差异(图4B)。

　　伊布替尼联合CD19 CAR-T细胞组的荧光素酶表达较泽布替尼联合CAR-T细胞组(P28天＜0.0001)消失更明显。泽布替尼联合CD19 CAR-T细胞组的荧光素酶表达消失大于CD19 CAR-T治疗组，但差异无统计学意义(P28天>0.05)。也就是说，在体内，伊布替尼明显提高CAR-T细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用（图4A、4C）。

　　CD19 CAR-T细胞的体内扩增

　　分析CD19 CAR-T细胞单药治疗组和CD19 CAR-T细胞联合泽布替尼/伊布替尼多药治疗组的CAR-T细胞比例。CD19 CAR-T细胞+伊布替尼联合治疗组在治疗第14、21、28天CD19 CAR-T细胞比例均高于CD19 CAR-T细胞组(P14天= 0.0423, P21天<0.0001, P28天<0.0001)，提示在体内仅伊布替尼促进了CAR-T细胞的体内扩增(图4D)。

 

　　专家点评

　　本研究结果中：CAR-T细胞与淋巴瘤细胞共培养导致其PD-1表达升高，培养体系加入伊布替尼诱导CAR-T细胞PD-1表达下调，而泽布替尼未见该作用；淋巴瘤小鼠模型体内伊布替尼与CAR-T细胞具有协同作用、促进CAR-T细胞的扩增，缩小肿瘤体积，而泽布替尼与CAR-T细胞未见明显协同作用。

　　伊布替尼对T细胞ITK独特的抑制作用，可促进人体各类T细胞亚群数量正常化，调节T细胞分化及功能，促进有利于免疫功能恢复方向分化进而提高T细胞介导的免疫应答、抗肿瘤活性以及免疫监视功能。目前多项研究显示伊布替尼联合CAR-T治疗淋巴瘤可改善临床疗效，也有数据8，9显示联合方案降低了“细胞因子风暴综合征”的发生率和严重程度；而临床疗效的改善与伊布替尼对CAR-T细胞的扩增，对CAR-T细胞活性的提升，对CAR-T肿瘤细胞杀伤能力的改善，对CAR-T细胞分化调节等种种免疫改善作用有关。

　　本研究未观测到泽布替尼联合CAR-T治疗淋巴瘤具有明显协同作用。此外ZUMA-2研究也有类似的结果，在接受CAR-T治疗的MCL患者中，与既往接受过阿卡替尼治疗的患者相比，既往伊布替尼治疗可提高CAR-T细胞在体内扩增的峰值与AUC水平，且缓解水平，缓解持续时间和无进展生存期均更好10。

　　CD19 CAR-T细胞与BTKi具有协同作用，但最佳的联合方式（序贯和或联合）、联合时机（BTKi起始/中止时间）均尚在探索中。对此，天津市第一中心医院团队在R/R DLBCL中对这些问题做了研究，初步发现在CAR-T细胞治疗前接受BTKi治疗＞2个月时，缓解会更好，研究数据也将在近期发布。

　　鉴于临床数据的有限性，CAR-T细胞与BTKi治疗淋巴瘤的协同作用还需要进一步探索中。希望未来为R/R B细胞淋巴瘤患者带来更大的临床获益。

　　参考文献：

　　1.J Clin Oncol. 2022 Jun 4:JCO2102370

　　2.Cancer Sci. 2021 Jul;112(7):2642-2651.

　　3.Blood. 2016 Mar 3;127(9):1117-27.

　　4.2020 ASH , Poster 1200.

　　5.Blood Adv. 2022 Nov 8;6(21):5774-5785.

　　6.Cancer Sci. 2020 Nov;111(11):4051-4060.

　　7.Technol Cancer Res Treat. 2022 Jan-Dec;21:15330338221133224.

　　8.Blood. 2020 May 7;135(19):1650-1660

　　9.ASH 2018. 299.

　　10.Wang M, et al. J Clin Oncol. 2022 Jun 4:JCO2102370

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