核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum, Fn) 是结直肠癌 (CRC) 组织中的优势细菌，与癌症进展和较差的患者预后有关，筛选能够抑制核梭杆菌活性的化学药物以及探究其在瘤内微生物群的作用下如何抑制核梭杆菌的活性至关重要。

　　2022年11月，LaCourse等人在国际权威期刊Cell Reports上发表了一篇研究文章，作者不仅确定了能够抑制CRC患者中核梭杆菌的药物，而且基于建立的机器学习模型分析了宏基因组数据中可以修饰该药物活性的微生物。

 

　　背景介绍

　　结直肠癌 (CRC) 肿瘤细胞存在于复杂的微环境中，其中包括与某些细菌的密切关联。基因组分析一致地揭示了与非癌性结肠组织相比，人类结肠癌中有核梭杆菌 (Fn) 的富集。过去的研究表明，Fn有助于肿瘤发生和加速癌细胞生长，且用抗生素甲硝唑治疗小鼠Fn阳性人类CRC异种移植物可显著降低肿瘤生长和癌细胞增殖，表明靶向Fn可能是CRC患者的一种治疗方法。由于甲硝唑的广谱抗微生物活性，它也可以靶向肠道菌群的有益成员，所以确定具有窄谱活性的Fn抑制剂是该项目前期研究的关键。

　　在针对Fn CRC分离物的1,846种生物活性化合物的小分子抑制剂筛选之后，作者发现15% 抑制剂是包括氟嘧啶在内的抗肿瘤剂。对这些发现的验证表明，一线CRC化疗药物5-氟尿嘧啶 (5-FU) 是Fn CRC分离株的有效抑制剂。作者还确定了对5-FU具有抗性的肿瘤内微生物群成员，包括大肠杆菌。此外，CRC大肠杆菌分离株可以修饰5-FU并减轻5-FU对其他敏感的Fn和人CRC上皮细胞的毒性。

　　最后，作者证明了离体的CRC肿瘤微生物群在5-FU暴露后会发生群落的破坏，并且有可能耗尽5-FU水平，从而降低局部药物功效。

　　图1：图形摘要

 

　　研究结果

　　Fn抑制剂的生物活性化合物库筛选

　　为了探究哪些类别的药物可以抑制Fn的生长，作者从“生物活性化合物” 库中随机选择了1,846个小分子 (32μm)（图2A）。为探究它们抑制人体CRC分离株Fn亚种的生长能力，研究鉴定了34种在肉汤培养中抑制Fn生长的化合物（图2B），结果表明抑制剂的15%被分类为作用于胸苷酸合酶、雌激素受体或拓扑异构酶II的抗肿瘤药 (图2C)，其中，主要的CRC化疗药物替加氟及其活性代谢产物5-FU被鉴定。此外，为验证和扩展这些初步发现，作者使用0.23至30 μm的8点剂量反应曲线监测了24种化疗药物存在下的Fn生长。作者发现5-FU及其前药替加氟是Fn生长的有效抑制剂 (图2D)。这些初步数据表明，CRC的标准化疗可以同时抑制肿瘤部位的Fn生长。

　　图2 生物活性文库筛选可识别几种抗肿瘤药物作为Fn生长抑制剂

 

　　FU是Fn CRC临床分离株的有效抑制剂

　　Fn是最主要的CRC相关细菌种类之一，然而Fn CRC临床分离株对5-FU (用于治疗CRC的主要化学疗法) 的敏感性以前尚未被探索。为此，作者首先评估了5-FU在来自CRC肿瘤组织 (n = 11)，口腔 (n = 2) 和发炎的肠易激疾病组织 (n = 1) 的分离株Fn中的半最大抑制浓度 (IC50)，将灵敏度定义为低于患者血清 (2.5-10 μm)中5-FU浓度的IC50值，将电阻定义为高于该范围的IC50值。分析表明，5-FU是大多数Fn菌株的有效抑制剂，其IC50值范围为0.14至4.3 μm (图3A）。同时证明了5-FU是代表所有四个亚种的Fn CRC分离株的有效生长抑制剂。

　　图3 Fn分离株对 5-FU 的生理浓度敏感曲线

 

　　CRC分离物修饰5-FU并减少对Fn和CRC上皮细胞的毒性

　　研究发现化疗后Fn在远处的结直肠癌转移中持续存在，表明在一部分患者中，尽管有5-FU毒性，但Fn仍可以忍受化疗，因此作者假设CRC肿瘤中同时出现的细菌种类可以通过整合或修饰化合物来保护Fn免受5-FU的侵害，从而降低药物毒性，Fn的存活会影响具有这些菌株的患者的疾病进展。

　　在探究上述问题时，文章使用13点剂量反应曲线测量了脆弱芽孢杆菌，大肠杆菌，短芽孢杆菌和微小微单胞菌的CRC肿瘤分离株的5-FU敏感性。所有测试的物种均对生理相关浓度的5-FU (2.5-10 μM) 具有抗性 (图4A)，结果表明这些菌株可能具有能够排毒5-FU的机制。接着作者使用LC-MS 在48小时内监测了这四种细菌菌株存在下的细胞外5-FU的浓度，并在24小时内观察到特别是在CRC大肠杆菌菌株存在下从细胞外培养基中清除5-FU (图4B)。

　　为测试细菌介导的5-FU耗竭是否影响Fn活力，在具有4μM 5-FU (该菌株的IC50的8倍) 的条件培养基中培养了动物脆弱芽孢杆菌，该培养基先前暴露于大肠杆菌或脆弱芽孢杆菌菌株。只有大肠杆菌修饰的5-FU挽救了动物脆弱芽孢杆菌的生长，脆弱芽孢杆菌没有从培养基中消耗5-FU，但未能消除5-FU的毒性 (图4C)，同时大肠杆菌菌素阳性菌株挽救了动物脆弱芽孢杆菌的生长 (图4C)。

　　为打消5-FU的大肠杆菌修饰是否可以改变其对CRC细胞的化学治疗功效的疑虑，作者用大肠杆菌暴露的5-FU (5μM) 培养了对5-FU敏感的 (IC50: 5μM) 人CRC上皮细胞系 (RKO)，并监测了72小时内的细胞生长，事先将5-FU暴露于大肠杆菌完全消除了5-FU对人CRC上皮细胞的毒性 (图4D)。

　　总的来说，细菌介导的5-FU消耗降低了针对邻近细菌细胞和人CRC肿瘤上皮细胞的药物功效。

　　图4 大肠杆菌分离物可消耗5-FU，并降低药物对Fn和人类的毒性结直肠细胞

 

　　CRC患者衍生的离体肿瘤微生物与5-FU相互作用

　　该环节作者试图确定5-FU暴露是否通过促进抗5-FU细菌种类的扩展来影响CRC微生物群的群落结构。为了产生离体CRC群落，在细菌肉汤中手动匀浆未经处理的CRC组织（n=6名患者），并通过16G针传代，直至均质。通过300 xg的缓慢离心将人细胞和碎片粉碎，留下悬浮的组织相关微生物群，剩下的细菌细胞分别在纯肉汤中或在高剂量5-FU (30μM)的存在下厌氧条件下培养48 h。接着利用宏基因组测序确定所得的群落结构 (图5A)，在分离之前，通过RNAscope荧光原位杂交（FISH）检查这些患者肿瘤等分试样中的细菌存在 (图5B)。宏基因组分析表明暴露于5-FU下会改变群落成员的相对丰度，从而导致5-FU耐药细菌的扩大 (患者CRC_01，CRC_04和CRC_06)。

　　然而，一些患者群落结构相对稳定表明这些人群对5-FU毒性的抵抗力 (患者CRC_02、CRC_03和CRC_05) (图5C)。为了确定这些离体CRC群落中的任何一个是否会影响5-FU的可用性，作者在48小时内评估了这些患者的离体微生物群存在下的5-FU水平。作者观察到50% 患者离体CRC群落中的5-FU快速耗竭 (图5D)，其中来自患者CRC_06的肿瘤微生物群 (图5D) 在从培养基中去除5-FU方面是最有效的。为了描述患者CRC_06中负责5-FU修饰的物种，作者培养了群落中三种最丰富的物种 (大肠杆菌、脆弱芽孢杆菌和双歧杆菌) 的分离株，并再次通过LC-MS评估了5-FU随时间的水平，与先前的观察结果一致，大肠杆菌菌株导致5-FU消失 (图5E)。

　　此外，对宏基因组学数据中前20个特征/物种的随机森林分析表明，大肠杆菌是5-FU暴露后“修饰者”组的分类，总体而言，具有最高的平均下降精度值，支持大肠杆菌作为模型中分类器的重要性。与此同时，线性判别分析效应大小 (LEfSe) 分析确定大肠杆菌与5-FU暴露后的 “修饰因子” 组显著相关（p<0.05）。

　　图5 患者来源的离体结直肠癌微生物群可消耗5-FU，降低化疗毒性

 

　　讨 论

　　肿瘤内菌群的细菌成员在CRC中具有代谢活性，并与恶性细胞一起与抗代谢物化疗药物5-FU相互作用。

　　作者的分析显示CRC肿瘤菌群和5-FU之间的相互作用是高度复杂的，细菌群落成员似乎符合三个不同的类别的药物：高敏感(如Fn)，耐药(如B. fragilis,B. breve，和P. micra)，抗性和耗竭性(E. coli)。暴露于5-FU后，体外CRC菌群的群落组成分析表明，在CRC患者的群落子集中，物种多样性有相当大的损失，这表明除了Fn外，其他细菌物种可能对5-FU敏感，这在最近的研究中也注意到，尽管不包括CRC分离株。相反，CRC肿瘤中的细菌有可能通过专门的核苷导入和嘧啶清除途径内化和解毒5-FU。

　　Fn在CRC组织中高度富集，多项研究表明Fn在病理和临床上与复发和患者预后有关。作者发现5-FU对Fn（n=11）的CRC肿瘤分离物具有有效的抗菌活性，平均IC50在毫微摩尔范围内（720 nM），表明基于5-FU的化疗治疗可以抑制患者肿瘤中这种癌微生物的生长。作为一种化疗药物，与其他癌症类型相比，5-FU在CRC中提供了最大的疗效，提出了一种有趣的可能性，即5-FU的治疗效果可能部分是由于其作为一种针对肿瘤内微生物群主要成员（包括Fn）的有效抗微生物剂所发挥的意想不到的作用。

　　Fn的存在也与治疗后的癌症复发有关。Yu等人的一项研究发现，与多个患者队列中的非复发CRC组织相比，梭杆菌在复发CRC组织中持续富集，细菌载量更高。在一项一致的研究中，Serena等人在来自局部晚期直肠癌患者（n=143）的58%的未经治疗的肿瘤活检中检测到Fn，并发现在使用基于氟嘧啶的新辅助放化疗（nCRT）治疗的肿瘤中，Fn持续存在26%。nCRT后组织中的Fn阳性，而不是其在组织中的基线状态，与患者复发风险增加7.5倍显著相关。这项工作支持这两项研究；作者预计Fn在5-FU毒性中存活的患者亚群可能包含能够代谢5-FU、保护癌细胞和Fn等阳性细菌细胞并促进CRC复发的肿瘤内细菌群落。

　　这项工作的体外研究表明，5-FU的微生物群相关修饰可能有助于患者5-FU化疗耐药性。在人类中，胸苷酸合成酶、核苷导入物和多药外排泵的表达变化有助于患者对5-FU的化学耐药性。鉴于这些类别的蛋白质也存在于许多细菌物种中，重复暴露可能会选择导致5-FU耐受的这些途径中的突变。有必要进行临床研究，评估肿瘤内Fn和5-FU修饰微生物群（如大肠杆菌）的共存，以及患者对5-FU类化疗药物的反应。更详细地了解细菌介导的5-FU化疗耐药的潜在机制，有助于对患者进行分层，以进行化疗药物和靶向抗微生物药物的组合治疗。

　　参考文献：

　　LaCourse KD, Zepeda-Rivera M, Kempchinsky AG, Baryiames A, Minot SS, Johnston CD, Bullman S. The cancer chemotherapeutic 5-fluorouracil is a potent Fusobacterium nucleatum inhibitor and its activity is modified by intratumoral microbiota. Cell Rep. 2022 Nov 15;41(7):111625. doi: 10.1016/j.celrep.2022.111625. PMID: 36384132.

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