1 文章概览

　　原文标题：Type I interferon signature and cycling lymphocytes in macrophage activation syndrome

　　中文标题：巨噬细胞活化综合征中的I型干扰素特征和循环淋巴细胞

　　期刊名：The Journal of Clinical Investigation

　　影响因子IF：15.9

　　发表时间：2023.9.26

　　相关技术：Bulk RNA-seq、scRNA-seq

 

　　2文章导读

　　巨噬细胞激活综合征（MAS）是斯蒂尔氏病（Still’s disease，SD）一种危及生命的并发症，其特征是明显的免疫细胞激活和细胞因子风暴。与健康对照组和无MAS的SD患者相比，SD合并MAS患者的PBMC RNA-seq显示，除了预期的IFN-γ信号外，与I型干扰素（IFN-I）信号传导和细胞增殖相关的基因表达强烈。scRNA-seq分析确认IFN-I和IFN-γ特征，并将细胞增殖特征定位于循环淋巴细胞中的CD38+HLA-DR+T细胞和NK细胞。CD38+HLA-DR+T细胞和NK细胞表现出显著的IFN-γ产生、糖酵解和mTOR信号传导。细胞-细胞相互作用模型表明，CD38+HLA-DR+细胞与单核细胞通过IFN-γ信号连接。在MAS中CD38+HLA-DR+细胞的扩增大于其他全身性炎症的儿童。体外刺激PBMC表明，IFN-I和IL15协同增强了CD38+HLA-DR+T细胞和NK细胞的产生，而JAK激酶抑制则减轻了这种反应。这些发现有助于阐明MAS在SD中的发病机制。

 

　　3技术路线

　　4研究背景

　　斯蒂尔氏病（SD）的特点是反复发热、皮疹、关节炎和全身炎症。巨噬细胞激活综合征（MAS）是SD患者死亡的主要原因，这是一种由免疫细胞过度激活引起的细胞因子风暴综合征，发生在10-30%的SD患者中。

　　虽然IL-1和IL-6是SD的治疗靶点，但IL-18和IFN-γ（也称为II型干扰素）是MAS病理生理的关键因素，高水平的这些细胞因子及其下游产物可以作为MAS的诊断标志物。

 

　　5研究方法

　　取健康组和有、无MAS的SD患者的外周血单核细胞（PBMC），使用bulk RNA测序（bulk RNA-seq）和单细胞RNA-seq（scRNA-seq）进行分析。通过质谱流式细胞技术、流式细胞术和体外研究验证并扩展了研究结果。

 

　　6研究结果

　　01 MAS中干扰素（IFN）和细胞循环途径激活

　　图1 MAS患者中存在干扰素和细胞循环途径特征研究

 

　　在RNA-seq实验中，作者对MAS组（SD患者有MAS）、SD组（SD患者无MAS）和健康人的外周血单核细胞（PBMC）进行测序。与健康组相比MAS组上调基因网络分析显示，INF-I响应、INF-γ响应、炎症响应、E2F靶基因和G2/M DNA损伤检测点相关基因聚集（图1 A）。基因集富集分析（GSEA）显示，在MAS组中INF-I响应、INF-γ响应、炎症响应、E2F靶基因和G2/M DNA损伤检测点相关基因高度富集（图1 B-D和图1 F）。热图显示，与健康组和SD组相比MAS组中INF-I响应、INF-γ响应、E2F靶基因和G2/M DNA损伤检测点相关基因表达上调（图1 E、I）。IFN-γ标记基因集获得的复合基因集评分显示。综上所述，PBMC的RNA-seq揭示了MAS中存在干扰素（IFN-I、IFN-γ）和细胞循环途径（E2F Targets、G2/M Checkpoint）特征。

　　图2 SD和MAS患者的单细胞转录组分析

 

　　作者对MAS组、SD组和健康组的PBMC进行单细胞测序，联合UMAP显示识别出15个主要的细胞亚群，然后根据定义的标记对这些细胞亚群进行注释（图2 A、B）。细胞亚群的定量比较显示，与SD组和健康对照组相比，MAS患者的循环淋巴细胞群明显增加（图2 C、D）。循环淋巴细胞亚群特异性表达细胞增殖生物标记物MKI67、TOP2A和BIRC5（图2 E）。循环淋巴细胞亚群的GSEA显示，MAS组中E2F靶点和G2/M检查点基因集富集，而IFN-I和IFN-γ响应基因集在大部分免疫细胞亚群富集（图2 F）。并且干扰素响应基因在单核细胞和树突状细胞中最为显著（图2 G）。综上所述，MAS中循环淋巴细胞亚群中干扰素和细胞循环途径被激活。

 

　　03与MAS相关的循环淋巴细胞亚群分析

　　

　　图3 MAS患者循环淋巴细胞亚群的scRNA-seq分析

 

　　基于scRNA-seq数据，作者使用CellChat分析确定了MAS组、SD组和健康组中主要细胞亚群的传出和传入信号通路。MAS组中循环淋巴细胞亚群被预测与其他细胞亚群相互作用（图3 A）。循环淋巴细胞亚群被认为是IFN-γ的主要产生者（发送者），IFN-γ刺激CD14+和CD16+单核细胞（受体）（图3 B、C)。另一方面，CD16+单核细胞被预测为肿瘤坏死因子（TNF）的主要来源，它作用于循环淋巴细胞、单核细胞、记忆T细胞和NK细胞(图3 C)。在MAS中富集的循环淋巴细胞亚群由CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞组成(图3 D)。这三个细胞中均表达CD38和HLA-DR(图3 E)。与MAS患者的初始T淋巴细胞亚群、记忆T淋巴细胞亚群和NK细胞亚群相比，循环淋巴细胞亚群表现出参与细胞增殖、糖酵解和mTOR信号传导的基因表达增强(图3 F)，表明循环淋巴细胞亚群具有高度的代谢活性。循环淋巴细胞亚群中CD8+T细胞和NK细胞中穿孔素和颗粒酶（细胞溶解功能）的表达显著，循环淋巴细胞亚群中CD4+和CD8+T细胞的IFNG表达水平高于所研究的其他细胞亚群（图3 G、H），这支持了早期的细胞-细胞相互作用数据，表明循环淋巴细胞亚群是MAS中IFN-γ的主要产生者。

 

　　04 CD38+HLA-DR+淋巴细胞在MAS和其他儿童炎症性疾病中的作用

　　图4 CD38+HLA-DR+淋巴细胞的流式细胞术分析

 

　　质谱流式细胞实验表明，相对于健康组、非系统性幼年特发性关节炎组（snJIA）、无MAS并发症的SD组（Inactive/Active SD），MAS并发症的SD组中CD38+HLA-DR+淋巴细胞在CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞中比例明显更高（图4 A-C）。ROC表明CD38+HLA-DR+淋巴细胞在T细胞和NK细胞的比例使得区分MAS和非MAS的SD具有高度的敏感性和特异性（图4 D）。6名MAS患者的随访样本的流式细胞实验进一步支持T细胞和NK细胞中CD38+HLA-DR+淋巴细胞与MAS的关联，这些患者在治疗后，CD38+HLA-DR+淋巴细胞在T细胞和NK细胞显著减少（图4 E、F）。

　　图5儿童炎症条件下CD38+HLA-DR+淋巴细胞的定量分析

　　质谱流式细胞实验表明，相对于健康组（HC-adult/children），SD-MAS组、儿童多系统炎症综合征组（MIS-C）和MAS引发的其他疾病组（other MAS）中CD38+HLA-DR+淋巴细胞在CD4+T细胞、CD8+T细胞中比例明显更高。但是MIS-C组中CD38+HLA-DR+淋巴细胞在CD4+T细胞、CD8+T细胞群中比例明显比SD-MAS组和other MAS组低（图5 A、B）。在SD-MAS、MIS-C、KD、和other MAS患者中，CD38+HLA-DR+淋巴细胞在NK细胞中占比较高（图5 C）。

　　综合图4和图5的结果表明，CD38+HLA-DR+淋巴细胞在T细胞和NK细胞高表达与MAS相关，但是跟自身免疫疾病合并MAS（SLE、JDM、snJIA）不相关。

 

　　05 CD38+HLA-DR+T细胞的体外培养

　　图6 CD38+HLA-DR+T细胞和NK细胞的体外生成

　　基于之前在MAS中对IFN-I观察，测试了IFN-I是否与其他细胞因子联合诱导CD38+HLA-DR+T淋巴细胞和NK细胞的产生。体外诱导实验发现IFN-α2（属于IFN-I）和IL-15（细胞因子）联合使用促使正常PBMC中CD38+HLA-DR+T细胞和NK细胞的扩增(图6 A、B)。IL-15由单核细胞和树突状细胞产生，是T淋巴细胞和NK细胞的有效激活剂。与健康组、无MAS并发症的SD组和nsJIA组相比，MAS患者血浆中IL-15水平较高，这支持了IL-15在MAS中的作用(图6 C)。对IL-15的机制研究表明，IL-15能够诱导下游Janus激酶（JAK）磷酸化。并且之前的单细胞测序分析表明循环淋巴细胞中mTOR信号通路基因表达升高，因此通过使用JAK抑制剂（Ruxolitimib和Tofacitinib）和mTOR抑制剂（Rapamycin）抑制这些细胞因子诱导的CD38+HLA-DR+T和NK细胞的发育(图6 D、E)。综上所述，IFN-α2和IL-15促使正常PBMC中CD38+HLA-DR+T细胞和NK细胞的扩增，JAK抑制剂（Ruxolitimib和Tofacitinib）和mTOR抑制剂（Rapamycin）能够抑制IFN-α2和IL-15诱导的CD38+HLA-DR+T细胞和NK细胞的扩增扩增。

 

　　7总结与讨论

　　该工作描述了IFN-I信号的转录特征，以及SD合并MAS中循环T淋巴细胞和NK细胞的扩增。该文证明了IFN-I（IFT-α2）和IL-15的联合使用刺激了体外CD38+HLA-DR+细胞的产生，并提供了病毒感染与SD合并MAS之间的机制联系，这个机制可能被JAK抑制剂干扰。这些发现有助于阐明MAS在SD中的发病机制。

　　参考文献：

　　Huang Z,Brodeur KE,Chen L,et al.Type I interferon signature and cycling lymphocytes in macrophage activation syndrome[published online ahead of print,2023 Sep 26].J Clin Invest.2023;e165616.doi:10.1172/JCI165616

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